크로마토그래피의 발전으로 연구자들은 다양한 종류의 화학물질과 생체 분자를 정제할 수 있게 되었고, 이는 생물학, 화학, 그리고 인간 건강에 있어 근본적인 발견으로 이어질 수 있는 문을 열었습니다. 크로마토그래피는 이제 실험실에서 널리 활용되고 있지만, 모든 경우에 적용되는 단순한 방법은 아닙니다. 이처럼 잘 발달된 과학 뒤에는 연구자들이 순도 목표를 달성할 수 있도록 수십 년에 걸쳐 개발된 전문적인 기술이 존재합니다.

크로마토그래피 101

1901년, 러시아 식물학자 Mikhail Tsvet는 탄산칼슘으로 채워진 컬럼을 사용하여 특정 식물 색소를 분리함으로써 생물학 연구에서 크로마토그래피를 개척했습니다. 오늘날 액체 크로마토그래피(LC)는 가장 널리 사용되는 생화학 분리 기술 중 하나이며, 일반적으로 2상(two-phase) 접근법으로 수행됩니다. 첫째, 일반적으로 완충액과 용매 사이의 극성 차이에 의존하는 이동상, 둘째, 실리카겔과 같은 흡착제에 의존하는 정상 또는 고체상입니다.

Tsvet의 실험 이후 고성능 액체 크로마토그래피부터 이온 크로마토그래피까지 다양한 LC 분석법이 개발되었습니다. 그러나 일반적으로 이러한 방법은 혼합물의 조성에 대한 정보를 수집하는 분석법과 관심 화합물의 대량 정제를 목표로 하는 분취법으로 분류할 수 있습니다.

실험적으로, 분취용 LC는 분석용 LC와 규모 면에서 차이가 있습니다. 분취용 LC 컬럼은 분석용 LC 컬럼처럼 표적 화합물을 분리하기에 충분한 머무름과 효율을 갖춰야 하지만, 훨씬 더 많은 양의 시료를 처리해야 합니다.

Nebraska-Lincoln 대학의 화학과 교수인 David Hage에 따르면, 이러한 용량은 종종 분취용 LC 컬럼을 한계에 이르게 한다고 합니다.

"대부분의 분석 방법은 한 번에 소량의 타켓 물질 및 시료를 처리하기 때문에 일반적으로 Linear elution Condition이 적용됩니다. 하지만 분취용 LC에서는 이러한 조건이 적용되지 않는 경우가 많습니다."

– David Hage

"대부분의 분석 방법은 한 번에 소량의 타켓과 시료를 다루기 때문에 일반적으로 Linear elution Condition이 적용됩니다. 하지만 분취용 LC에서는 그렇지 않은 경우가 많습니다."라고 Hage는 설명합니다. 분취용 LC에서 시료량이 많으면 비선형 조건과 넓고 겹치는 용출 피크가 발생할 수 있습니다. 이는 어려운 문제입니다. 많은 연구자들이 처리량을 극대화하고 가장 낮은 비용으로 가장 많은 양의 표적을 얻기 위해 분취용 LC 컬럼에 의도적으로 과부하를 가하지만, 이는 자신의 연구를 저해할 위험이 있습니다.

전술적 접근 방식

Hage에게 분취 LC에서 비선형 조건을 피하는 것은 규모를 작게 유지하는 것만큼 간단할 수 있습니다. 그의 연구실에서는 크로마토그래피 기반 면역 분석법 개발에 분취 LC를 사용하고 있으며, 더 작은 규모에서는 비선형 문제가 종종 감소하는 것을 확인했습니다. 하지만 그는 더 작은 규모에서도 분취 LC 응용 분야로 전환하는 과정에서 여전히 때때로 문제가 발생할 수 있다는 것을 인정합니다.

이러한 경우, 그는 "분석 컬럼의 머무름 및 용출 데이터를 사용하는 것이 분취법 개발의 좋은 시작점이 될 수 있습니다."라고 말합니다. 그럼에도 불구하고, Hage는 분석 데이터만으로는 일반적으로 효과적인 분취 LC 실험을 계획하기에 충분하지 않으며, 거의 항상 추가적인 최적화가 필요하다는 점을 인정합니다. 다른 최적화 방법으로는 컬럼 로딩이 머무름 시간과 용출 특성에 미치는 영향을 조기에 파악하고, 온라인과 제조업체 웹사이트에서 제공되는 특별히 개발된 스케일업 방정식과 계산기를 사용하여 컬럼 크기에 따른 주입량과 유속을 추정하는 것이 있습니다.

"저희는 기울기 용를 사용하지만, 더 중요한 것은 기울기를 늦추고 얕은 용출을 통해 관심 있는 피크를 얻는다는 것입니다."라고 Hodges는 말합니다. 그는 또한 분취용 LC 실험에 분석 장비와 컬럼을 사용할 수 있어 스케일링이 간편합니다.

"분석 스케일을 사용하여 분석법을 확립하고, 분취 스케일을 사용하여 화합물을 정제하고, 다시 분석 스케일을 사용하여 확증을 얻고 싶을 때 복합 시스템은 매우 유용합니다."라고 Martowicz 는 말합니다. 복합 시스템은 장비 비용을 절감하고 작업 공간을 절약할 수도 있습니다. 하지만 장단점이 있습니다. "분석 스케일과 분취 스케일 모두에 적합한 장비를 선택한다면 두 가지 조건에 모두 적합하지 않을 수 있습니다."라고 그녀는 말합니다. "예를 들어, 다른 스케일에 맞게 검출기의 플로우 셀을 변경해야 할 수도 있습니다."

복합 시스템 사용 가능 여부는 분리 대상에 따라 달라집니다. "LC에서 소분자와 펩타이드는 실제로 매우 다릅니다."라고 Hodges는 말합니다. 소분자는 컬럼 내에서 상호작용을 일으켜 샘플이 과부하될 경우 큰 문제를 일으킬 수 있으며, 이로 인해 용출 피크가 더욱 겹치고 정제 실험이 까다로워집니다. 그러나 펩타이드의 경우 이러한 상호작용은 무시할 수 있습니다.

"컬럼에 상당한 양의 원액을 넣어도 펩타이드 분석에서 훌륭한 결과를 얻을 수 있습니다."라고 그는 말합니다. 또한, 이 모든 작업은 일반 직경의 분석 컬럼을 사용하여 수행할 수 있으므로 스케일링 문제는 훨씬 덜 심각합니다.

결론적으로, 프렙용 LC가 위험이 없는 것은 아닙니다. 하지만 세부적인 계획, 목표 설정, 그리고 초기 최적화 단계를 거치면 대량 생산, 빠른 속도, 그리고 높은 순도라는 상당한 이점을 얻을 수 있습니다.

Gilson, Inc는 위의 VERITY GX-271 HPLC 시스템을 포함하여 다양한 액체 크로마토그래피 시스템을 생산하고 있으며 , 연구자들과 협력하여 특정 목적에 맞는 시스템을 구성합니다.