공유 결합으로 연결된 짧은 아미노산 사슬인 펩타이드는 점점 더 발전하는 의약품입니다. FDA 승인 의약품의 약 6%를 차지 하지만, 매년 더 많은 펩타이드가 임상시험에 진입함에 따라 치료제로서의 펩타이드에 대한 관심이 높아지고 있습니다 .

일반적으로 펩타이드는 다음을 포함한 여러 가지 방법을 통해 생성됩니다.

• 화학 합성: 펩타이드 사슬은 한 번에 아미노산 하나씩 처음부터 합성됩니다. 여기에는 불용성 중합체 위에 펩타이드를 합성하는 고체상 펩타이드 합성 (SPPS)과 같은 방법이 포함됩니다. 용액 상태에서 수행되는 액상 펩타이드 합성(LPPS)은 입체 장애로 인해 고체 지지체에서 펩타이드를 합성하기 어려울 때 유용합니다. 고속 유동 SPPS(FF-SPPS)와 같은 다른 SPPS 기술은 연속 유동 화학을 사용하여 펩타이드 순도를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.
• 효소 가수분해: 효소가 단백질을 분해하여 생리활성 펩타이드를 방출합니다.
• 발효: 미생물이 기질을 원하는 펩타이드로 분해합니다.
• 재조합 DNA: 조작된 미생물이 표적 펩타이드를 생산합니다.

이러한 방법은 원하는 생성물을 생성하지만, 원치 않는 부반응, 절단된 펩타이드와 같은 생성물 관련 불순물 이나, 세포 기반 방법을 사용하여 펩타이드를 생산할 경우 세포 파편, DNA, 염과 같은 공정 관련 불순물을 생성합니다 . 이러한 불순물은 펩타이드를 후속 공정에 사용하기 전에 제거해야 합니다. 공정 관련 불순물은 친화성 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 제거할 수 있지만, 생성물 관련 불순물은 원하는 생성물과 유사한 특성을 가지므로 역상 액체 크로마토그래피와 같은 더 엄격한 방법을 사용하여 제거해야 합니다.

다양한 정제 방법이 있으므로 여러 기술을 함께 사용하여 펩타이드의 순도를 높일 수 있습니다. 이러한 사례는 문헌에 많이 나와 있습니다. 예를 들면 다음과 같습니다.

• 음이온 교환과 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피를 동시에 가능하게 하는 혼합 모드 컬럼
• 역상 액체 크로마토그래피로 분리한 후 UV, 형광 및 질량 분석법을 이용한 검출
• Gilson의 VERITY 271 LC-MS를 사용하여 동시 용출 화합물을 식별하고 표적 화합물 수집을 시작하기 위해 UV 및 질량 분석법을 동시에 감지합니다.

이 기사에서는 공정 관련 불순물과 제품 관련 불순물로부터 펩타이드를 정제하는 데 사용되는 다양한 정제 및 검출 방법을 다룹니다.

정제 기술

역상 액체 크로마토그래피(RPLC)

역상 액체 크로마토그래피는 펩타이드 정제에 가장 널리 사용되는 방법이며, 구조가 유사하여 잘린 펩타이드 또는 분지형 펩타이드에서 표적 펩타이드를 분리하는 데 이상적입니다. RPLC에서의 분리는 비극성 고정상과 극성 이동상을 사용하여 소수성을 기반으로 합니다. 펩타이드와 고정상 사이의 소수성 상호작용은 펩타이드를 컬럼에 고정시키는데, 소수성 펩타이드가 친수성 펩타이드보다 컬럼에 더 오래 머무르는 경향이 있습니다.

이온 교환 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피는 전하를 기준으로 펩타이드를 분리합니다. 펩타이드는 서로 다른 전하를 띠기 때문에, 이온 교환 크로마토그래피는 반대 전하를 가진 수지를 사용하여 펩타이드를 포집하는 동시에 다른 분자는 세척합니다. 그런 다음 염 농도 구배를 사용하여 전하를 기준으로 펩타이드를 용출할 수 있는데, 약하게 결합된 펩타이드(전하가 낮은 펩타이드)가 먼저 용출되고, 강하게 결합된 펩타이드(전하가 높은 펩타이드)가 먼저 용출됩니다.

그러나 이온교환 크로마토그래피는 비휘발성 염을 고농도로 사용하기 때문에 질량 분석법 검출과 호환되지 않습니다.

친화성 크로마토그래피

친화성 정제 방법은 펩타이드에 대한 수지의 특이성을 기반으로 하며, 고정화된 금속 이온을 사용하여 히스티딘이나 펩타이드에 특이적인 항체를 포함하는 펩타이드를 정제할 수 있습니다. 펩타이드가 수지에 결합하는 동안 다른 모든 분자는 컬럼 밖으로 흘러나옵니다. 이후 펩타이드를 용출시켜 추가 처리를 진행할 수 있습니다.

친화성 정제는 단백질 소화 후 공정 관련 불순물을 분리하기 위해 펩타이드 정제의 포획 단계에서 가장 잘 사용됩니다.

정제는 필요한 양과 순도에 따라 카트리지(SPE)나 컬럼을 이용해 수행할 수 있습니다.

검출 방법

위의 기법을 사용하여 분자를 분리한 후, 검출기를 사용하여 표적 분자가 언제 용리되는지 식별합니다. 일반적인 검출 방법으로는 자외선/가시광선 및 질량 분석법이 있습니다.

자외선-가시광선

자외선/가시광선(UV-Vis) 검출은 분자가 자외선 또는 가시광선을 흡수하는 원리를 이용합니다. 이 방법은 특정 아미노산이 서로 다른 파장의 빛을 흡수한다는 사실에 기반합니다(예: 278nm의 트립토판, 274nm의 티로신, 257nm의 페닐알라닌, 211nm의 히스티딘). 이 방법은 분리 후 펩타이드를 검출하는 데 일반적으로 사용됩니다. 그러나 UV-Vis는 질량 분석법과 같은 다른 방법보다 감도가 낮으며, 고분해능 UV 스펙트럼을 사용하지 않는 한 UV-Vis 검출기는 구조 정보를 제공할 수 없습니다.

질량 분석법

시료 내 분자를 이온화하여 질량 대 전하 비를 기준으로 분리하는 질량 분석법은 화학 합성 과정에서 생성된 생성물 관련 불순물로부터 표적 펩타이드를 검출하는 데 도움을 줄 수 있습니다. RPLC 용매는 MS와도 매우 잘 호환되므로 RPLC와 MS를 쉽게 연결할 수 있습니다. 탠덤 질량 분석법을 사용하면 펩타이드의 서열을 확인할 수 있습니다.